拉曼光谱是一种通过检测分子的非弹性光散射，获取其分子振动和转动信息的光谱技术。作为荧光或其它成像方式的补充，拉曼光谱成像具有“指纹图谱”的高特异性、信号不易光漂白、易实现多重成像等优点，成为分析化学、材料科学和生物医学领域前景广阔的成像技术。但是，每1000万个入射光子中仅有1个会发生拉曼散射，因而小分子的自发拉曼成像信号是极微弱、难以检测的。为增强信号，目前策略主要依赖于表面增强拉曼散射（SERS）技术，即通过在金、银等基底材料表面吸附拉曼小分子，使信号放大108-1011倍，以实现高灵敏成像。SERS技术自2006年用于活体成像以来获得了显著进展。然而，这些SERS基底材料存在生物安全性问题，成为长久以来制约拉曼光谱成像技术在活体生物医学应用及转化的瓶颈问题。

近日，上海交通大学医学院肖泽宇教授、复旦大学陆伟教授、中国科学院杭州医学所方晓红教授团队合作，在Nature Biotechnology期刊在线发表了题为“Self-stacked small molecules for ultrasensitive, substrate-free Raman imaging in vivo”的研究论文，揭示了一类特定结构的小分子，不需要依赖基底，仅通过自身的有序堆叠，实现在活体中的高灵敏拉曼成像，并提出一种新的拉曼散射增强机理－“堆叠诱导电荷转移增强拉曼散射（SICTERS）”。该研究为设计生物安全的高灵敏拉曼影像探针，并推进拉曼影像分析技术的活体生物医学应用提供了新思路。

Nature Biotechnology杂志在同期以“Small molecules self-organized in an orderly manner to enhance Raman signals ”为题，对该工作从领域问题、科学发现、未来方向等方面进行了详细的亮点介绍，并配发了国际同行专家的评价，认为“这个原创性的工作代表了活体拉曼生物成像技术的突破，并有潜力将其应用于临床－This original and innovative work represents a breakthrough for in vivo Raman bioimagingand its potential translation to clinical use.”

在本工作中，研究团队揭示一类以双噻吩基取代作为供体（D）、苯并双噻二唑作为受体（A）的共轭有机小分子（如BBT）。该类分子具有D-A-D的平面构象和平面内的多环振动模式；分子能够在空间中有序自堆叠，使其相邻分子间D和A单元的间距在3.6Å左右，促进了相邻分子供体D和受体A单元间在分子内及分子间的电荷转移。一个受体可以完全接收来自六个供体（D2-A--D4）的电子，其中包括两个分子内供体和四个分子间供体。同时，一个供体可以向三个受体（A-D--A2）提供电子，包括一个分子内受体和两个分子间受体（图1a）。这样的空间排列及相互作用重新调整了电荷分布，形成了新型的三维电荷转移，显著增加分子自身极化率，并增强拉曼散射。研究团队将此类增强拉曼散射定义为堆叠诱导电荷转移增强拉曼散射（SICTERS）。

为实现活体生物医学应用，研究团队进一步开发了SICTERS探针—临床可用的DSPE-PEG剂型包覆的BBT纳米粒（BBT NPs），该纳米剂型显著提升了BBT在体内系统循环时的稳定性。此外，研究人员制备了与BBT NPs尺寸相近的SERS探针—金纳米粒（Au NPs），并进行了拉曼散射增强能力的定量比较。研究表明，基于SICTERS技术的BBT NPs每个粒子的拉曼散射截面是基于SERS技术的Au NPs的1350倍。重要的是，基于SICTERS技术的BBT探针在组织脏器中的分布水平随时间推移显著降低，并经肝脏代谢粪便排出，血液学及组织学分析也展示了生物安全性；而SERS技术的金探针在肝脏等组织脏器中长期滞留，难代谢消除。

最后，研究团队探索该技术用于活体术中微小肿瘤成像、无创淋巴回流成像及微小血管成像等生物医学应用。结果表明，SICTERS探针能以最低1mg/kg的给药剂量（相比SERS探针4mg/kg）实现术中对微小肿瘤的高分辨成像，并指导切除，降低术后复发及转移。重要的是，SICTERS探针能够活体无创的对淋巴回流及微小血管（~11微米）进行高分辨拉曼成像，这是SERS探针难以实现的（图1b）。

图1：(a)堆叠诱导电荷转移增强拉曼散射（SICTERS）机理：具有D-A-D平面结构的小分子通过自身有序堆叠，促进了平面内和平面外的分子间电荷转移。这种空间排列重新调整了电荷分布，实现了三维电荷转移，从而大大增加了共振拉曼散射。(b) SICTERS探针用于活体术中微小肿瘤成像、活体无创淋巴回流成像，活体无创腹部皮下微小血管成像。

综上，SICTERS在活体拉曼成像分析方面具有两个显著优势：首先，SICTERS不依赖于基底增强，从而避免SERS可能带来的生物安全性问题；其次，SICTERS技术在活体成像的灵敏度、空间分辨率和成像深度方面均优于SERS。SICTERS作为一种新的增强拉曼散射增强机理，为拉曼成像探针的分子设计提供了新的方向。

上海交通大学医学院肖泽宇教授、复旦大学陆伟教授、中国科学院杭州医学所方晓红研究员为该论文的共同通讯作者。复旦大学高帅博士、上海交通大学医学院张永明博士、助理研究员崔凯为该论文的共同第一作者。本研究得到了国家重点研发计划，国家自然科学基金委重大研究计划、国际（地区）合作项目，上海市科委重点专项、上海市卫健委学科带头人计划等多项资金的资助。

论文链接：https://www.nature.com/articles/s41587-024-02342-9